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NCG

品系名称:NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt

品系类型:Knock out

品系编号:T001475

品系背景:NOD/ShiLtJGpt


1. 品系描述

NCG (NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt)是使用基因编辑技术敲除了NOD/ShiltJGpt小鼠的Prkdc(Protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide)及Il2rg(Common gamma chain receptor)基因而获得的重度免疫缺陷品系。NOD/ShiltJGpt遗传背景使该品系具有天然免疫缺陷,如补体系统、巨噬细胞缺陷,同时,该背景Sirpa与人类CD47具有高亲和力,使NOD/ShiltJGpt比其它品系更适合人源移植物(如:肿瘤和人源细胞)的定植。 Prkdc基因功能缺失导致V(D)J重组不能正常发生,造成T细胞和B细胞不能发育成熟。IL2RG是多种白细胞介素细胞因子受体的共同亚基,IL2RG失活则导致6种不同细胞因子信号通路缺失,造成NK细胞缺陷。因此,NCG是迄今为止免疫系统缺陷最为彻底的小鼠模型之一,非常适合人源肿瘤细胞移植(CDX)、人源肿瘤组织移植(PDX)、人外周血单个核细胞(PBMC)及人源造血干细胞(CD34+ HSC)移植进行免疫重建。NCG生存周期长(>89周),利于长期移植及药效学评价。


2. 应用领域

(1)    人源免疫重建小鼠模型,如BLT人源化小鼠、PBMC人源化小鼠及CD34+人源化小鼠;

(2)    人源肿瘤细胞、肿瘤组织移植(CDX,PDX);

(3)    药效评价(小分子、大分子、联合用药);

(4)    人类癌症模型;

(5)    干细胞研究


3. 验证数据

(1)NCG免疫细胞分群检测图

1 NODNOD/ShiltJGpt)、NOD-scidNCG小鼠T/B/NK细胞比例检测

取5周龄NOD(NOD/ShiltJGpt)、NOD-scid及NCG雌鼠脾脏细胞进行流式检测,测定其T细胞(CD3+)、B细胞(CD19+)、NK细胞(CD335)及成熟B细胞(IgM+)比例。结果显示,与NOD相比,NOD-scid几乎没有T、B细胞,NK细胞比例代偿性上升。与NOD相比,NCG几乎没有T、B、NK细胞,免疫缺陷比NOD-scid更为彻底。

2 C57BL/6NCG小鼠DC/Macrophage/Neutrphil/Monocytes细胞比例检测

取5周龄C57BL/6和NCG雌鼠脾脏细胞进行流式检测,测定其DC细胞(CD11c)、Macrophage细胞(F4/80)、Neutrphil细胞及Monocytes细胞比例。结果显示,与C57BL/6相比,NCG几乎检测不到DC、Macrophage细胞,Neutrphil细胞和Monocytes细胞比例代偿性上升。


4. NCG小鼠在CDX中应用

3 人乳腺癌细胞系BT474MCF-7Nu/Nod-scid/NCG小鼠上的成瘤性测试

将对数生长期的人乳腺癌细胞系BT474和MCF-7接种至6-8周龄的Nu/Nod-scid/NCG小鼠皮下,随着时间肿瘤的大小呈梯度曲线增长。(肿瘤体积数值以Mean±SEM表示)


5. NCG小鼠在PDX中应用

4 结肠癌肝转移癌瘤(PDX)在NCG小鼠上的成瘤性测试,以及PDX标本切片结构

P1:患者肿瘤组织接种至NCG小鼠体内生长的第一代模型;P2:P1代肿瘤模型再次传代至其他NCG小鼠体内生长的第二代模型;由于穿刺样本量很少,生长速度较慢,P2代的生长速度明显提高。PDX标本代次之间均保留了高度分裂相细胞类型。

5 基于接种结肠癌肝转移癌瘤在NCG小鼠上的药效测试

与对照组G1相比,吉西他滨处理组、伊立替康处理组瘤重均有显著性下降。


6. 免疫重建

免疫系统人源化小鼠是指在重度免疫缺陷小鼠(如NCG)体内移植人的造血细胞、淋巴细胞或组织,获得具有人源免疫系统的小鼠模型,包括huPBMC-NCG和huHSC-NCG小鼠。免疫系统人源化小鼠结合CDX或PDX造模,可用于研究人类免疫系统环境下肿瘤的生长,评价抗肿瘤治疗方案,尤其是助力基于免疫治疗的新药开发。

1huPBMC-NCG  

huPBMC-NCG小鼠是将人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)移植到重度免疫缺陷小鼠NCG体内,从而获得的重建人免疫系统的NCG小鼠模型。在NCG小鼠上进行的huPBMC免疫重建效率高,速度快,重建后以淋巴T细胞为主,可用于多种肿瘤免疫药物的评价。huPBMC-NCG小鼠免疫重建后生存周期为5-7周,给药周期相对较短。由于T细胞重建速度非常快,人源T细胞会识别并攻击小鼠组织从而发生移植物抗宿主病(GvHD),因此该模型可以用来评价GvHD药物。由于huPBMC供体之间的差异性明显,为排除不同供体来源的PBMC对实验结果的影响,需要通过筛选Donor,保证huPBMC-NCG免疫重建的稳定性。

6 huPBMC-NCG小鼠的生存曲线

分别将来源于供体F和供体G的huPBMC注射到NCG小鼠中,分析huPBMC-NCG免疫重建小鼠的存活时间。由于植入的PBMC为异源免疫细胞,huPBMC-NCG小鼠会随着时间推移产生GvHD,缩短了huPBMC-NCG小鼠的使用窗口期。本研究发现NCG小鼠移植huPBMC一个月左右陆续出现死亡。

7 huPBMC-NCG免疫重建水平

利用流式细胞技术检测huPBMC-NCG小鼠人源化进程中外周血中人白细胞比例。随着时间推移,huPBMC-NCG小鼠外周血中人白细胞的比例逐渐增加,第三周时平均人白细胞比例超过50%。huPBMC-NCG免疫重建速度快,重建细胞以CD3+T细胞为主。数据以Mean ±SEM形式呈现。

8 基于huPBMC-NCG小鼠体内药效试验


基于
huPBMC-NCG小鼠体内GvHD药效研究分别使用两种不同Donor来源的huPBMC细胞构建huPBMC-NCG,并接种PDL1高表达细胞系MDA-MB-231构建皮下荷瘤模型。PBMC接种后会影响MDA- MB-231在NCG体内的成瘤速度。待肿瘤生长至平均体积约100 mm3时随机分为Vehicle(对照)组及Tecentriq给药组,使用相应药物进行治疗。每周给药2次,连续给药三周。结果显示Tecentriq对肿瘤生长有明显抑制作用(PBMC-01,TGI=45.41%;PBMC-02,TGI= 56.96%)。数据以Mean ± SEM形式呈现。




 

9 小鼠在重建后会出现GvHD表型,弓背,炸毛现象

10 基于huPBMC-NCG小鼠评价GvHD药物

将huPBMC尾静脉移植至辐照处理后的NCG小鼠(辐照会加速GvHD的反应),然后给药GvHD药物治疗。结果显示GvHD药物延长了huPBMC-NCG小鼠的生存周期,且随着给药剂量的增加,生存周期明显延长,体重增加。

2huHSC-NCG

huHSC-NCG小鼠是将人造血干细胞(CD34+HSC)移植到辐照清髓的重度免疫缺陷小鼠NCG体内,并分化产生各类造血或者免疫细胞,如T细胞、B细胞以及NK细胞等,从而获得免疫系统人源化的模型,重建后的免疫细胞类型较PBMC人源化小鼠丰富。以NCG小鼠为受体鼠,构建huHSC-NCG人源化小鼠。

NCG小鼠移植CD34+HSC后,相对于huPBMC重建速度慢,GvHD发生延迟,生存周期超过39周,延长了给药窗口期。huHSC-NCG小鼠的免疫重建效率高,主要重建T细胞和大量未成熟的B细胞,以及少量NK细胞和巨噬细胞等,可用于进行肿瘤免疫治疗药物的评价。

11 huHSC-NCG小鼠人源化模型实验设计流程图

12 NCG小鼠清髓效果检测

利用流式细胞技术检测辐照清髓效果。辐照可以清除小鼠骨髓中的造血干细胞,从而提高人源HSC移植后的重建水平。辐照后mCD45+mCD117+细胞群体比例为1.11%,显著低于未辐照组(13.5%)。

13 HuHSC-NCG小鼠的生存曲线及体重变化情况

左图表明huHSC-NCG小鼠存活时间可超过37周,且生存率与NCG野生型小鼠无明显差异。右图huHSC-NCG小鼠体重随时间变化呈增长趋势,与NCG野生型小鼠体重无显著差异。

14 huHSC-NCG重建效果鉴定

huHSC-NCG小鼠的免疫重建效率高,主要重建T细胞和大量未成熟的B细胞,以及少量NK细胞。

15 基于huHSC-NCG小鼠模型的体内药效评价

基于huHSC-NCG小鼠体内用药试验。将对数生长期人淋巴瘤细胞Raji细胞接种到huHSC-NCG小鼠皮下,待肿瘤生长至平均体积约40-50 mm3时,随机分为Vehicle组,Tri-TE给药组,Blincyto给药组,并使用相应的药物进行治疗。结果显示:Tri-TE组TGI=62.04%)及Blincyto给药组(TGI=51.14%)对huHSC-NCG的Raji细胞荷瘤鼠上肿瘤生长有抑制作用。


7. NCGCAR-T治疗上的应用

嵌合抗原受体细胞疗法(Chimeric Antigen Receptor T Cell,CAR-T)是肿瘤过继免疫治疗的新方法。CAR-T细胞具有靶向识别肿瘤抗原的能力,其杀伤肿瘤细胞无需进行抗原递呈,与以往免疫疗法相比,具有特异性高、攻击持久等优势。在恶性肿瘤,特别是血液肿瘤治疗中有很好的疗效。hth华体会手机app具有丰富的CDX和自主知识产权的PDX库,包括多种实体瘤和血液瘤,为CAR-T药效评价提供了丰富的肿瘤模型资源。同时,hth华体会手机app开发了外周血中CAR-T细胞绝对计数方法和细胞因子检测方法,满足CAR-T实验检测需求。

Nalm6-Luciferase细胞尾静脉接种到NCG小鼠后,第7天根据肿瘤负荷进行分组,分别给予Control T,CAR-T1及CAR-T2细胞治疗,并于D12,D19,D26利用活体成像技术检测肿瘤负荷。据体内成像及统计结果显示,与Control T相比,CAR-T1和CAR-T2细胞均能很好的抑制小鼠体内肿瘤生长,延长小鼠生存期。


8. NCG小鼠的生长曲线


9. 血常规

Hematology

Parameter

Units

18W(♂)

18W(♀)

WBC

103  cells/mm3

0.81

1.22

RBC

106  cells/mm3

9.06

8.92

HB

g/L

125.10

124.20

HCT

%

50.95

50.71

MCV

fL

56.14

56.82

MCH

Pg

13.83

13.93

MCHC

g/L

246.40

245.40

RDW

%

18.72

18.07

PLT

103  cells/mm3

780.80

564.78

MPV

fL

4.35

4.53

NE#

103  cells/mm3

0.48

0.56

NE%

%

60.55

51.32

LY#

103  cells/mm3

0.28

0.54

LY%

%

33.33

40.35

EO#

103  cells/mm3

0.01

0.05

EO%

%

1.57

3.25

MO#

103  cells/mm3

0.03

0.06

MO%

%

3.96

4.31

BA#

103  cells/mm3

0.00

0.01

BA%

%

0.60

0.77


10. 血生化


Biochemistry

Parameter

Units

18W(♂)

18W(♀)

ALT

IU/L

50.00

29.77

AST

IU/L

126.80

130.36

TP

g/L

37.95

34.90

ALB

g/L

2.19

1.69

AKP

IU/L

56.75

54.20

TBIL

μmol/L

66.20

91.53

BUN

μmol/L

10.38

12.47

CREA

μmol/L

20.31

30.15

CHOl

mmol/L

0.98

0.84

TG

mmol/L

1.69

1.18

HDL-C

mmol/L

39.75

47.50

LDL-C

mmol/L

/

/

Ca

mmol/L

2.37

2.28

P

mmol/L

3.04

2.51

Fe

μmol/L

2.48

1.88

GLU

mmol/L

7.06

5.46



11. 流式细胞

Flow cytometr

Parameter

Units

spleen

blood

8W/♂

8W/♀

8W/♂

8W/♀

B cells

% of leukocytes

0.90

0.29

0.23

0.23

NK cells

0.42

0.83

0.54

0.86

T cells

0.86

0.41

0.43

1.43

immature B

% of B cells

97.20

99.00

/

/

mature B

2.80

1.00

/

/

CD4+ T

% of T cells

0.12

0.00

0.00

0.00

CD8+ T

0.12

0.00

0.00

0.00


12. 已发表文献

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13. Zhang D P et al. (2020) The Agpat4/LPA axis in colorectal cancer cells regulates antitumor responses via p38/p65 signaling in macrophages. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5, 24.【NCG】

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15. Targeting the Lnc-OPHN1-5/Androgen Receptor/hnRNPA1 Complex Increases Enzalutamide Sensitivity to Better Suppress Prostate Cancer Progression(2019)【NCG】

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